自诱导培养基(lac启动子)(Auto-inductionMedium)
产品及特点
本产品是在pET专用生长培养基的基础上开发而成的,它利用E.coli自身对培养基中碳源和能源的调控利用机制,实现外源蛋白在细菌达到饱和期后的自动诱发。
AIM自诱导培养基介绍（zym自诱导培养基）
具有下列特点:
1.不需添加任何IPTG或相关诱导物,节约成本。
2.免去了密切监控菌液密度的过程,尤其适合大规模筛选。
3.细菌生长密度远高于IPTG诱导表达系统。
4.外源蛋白表达量远远高于IPTG诱导表达系统。
5.本产品即开即用,操作简单。
6.与各种细胞培养容器兼容(如培养瓶、培养罐、深孔管、发酵罐等)。
自诱导培养基(lac启动子)(Auto-inductionMedium)
操作步骤
(一)获得目的基因
1
、通过
PCR
方法:以含目的基因的克隆质粒为模板,按基因序列设计一对引物(在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点),
PCR
循环获得所需基因片段。
2
、通过
RT-PCR
方法:用
TRIzol
法从细胞或组织中提取总
RNA
,以
mRNA
为模板,逆转录形成
cDNA
第一链,以逆转录产物为模板进行
PCR
循环获得产物。
(二)构建重组表达载体
1
、
自诱导培养基(lac启动子)(Auto-inductionMedium)
载体酶切:将表达质粒用限制性内切酶(同引物的酶切位点)进行双酶切,酶切产物行琼脂糖电泳后,用胶回收
Kit
或冻融法回收载体大片段。
2
、
PCR
产物双酶切后回收,在
T4DNA
连接酶作用下连接入载体。
(三)
获得含重组表达质粒的表达菌种
1
、
将连接产物转化大肠杆菌
DH5
α,根据重组载体的标志(抗
Amp
或蓝白斑)作筛选,挑取单斑,碱裂解法小量抽提质粒,双酶切初步鉴定。
2
、
测序验证目的基因的插入方向及阅读框架均正确
,
进入下步操作。否则应筛选更多克隆,重复亚克隆或亚克隆至不同酶切位点。
3
、
以此重组质粒
DNA
转化表达宿主菌的感受态细胞。
(四)诱导表达
1
、
自诱导培养基(lac启动子)(Auto-inductionMedium)
挑取含重组质粒的菌体单斑至
2mlLB
(含
Amp50
μ
g/ml
)中
37
℃过夜培养。
2
、按
1
∶
50
比例稀释过夜菌,一般将
1ml
菌加入到含
50mlLB
培养基的
300ml
培养瓶中
,37
℃震荡培养至
OD600
≌
0.4-1.0
(*
0.6
,大约需
3hr
)。
3
、取部分液体作为未诱导的对照组
,
余下的加入
IPTG
诱导剂至终浓度
0.4mM
作为实验组
,
两组继续
37
℃震荡培养
3hr
。
4
、分别取菌体
1ml,
离心
12000g
×
30s
收获沉淀,用
100
μ
l1%SDS
重悬,混匀
,70
℃
10min
。
5
、离心
12000g
×
1min
,取上清作为样品
,
可做
SDS-PAGE
等分析。
自诱导培养基常见种类
