大家好，活细胞工作站相信很多的网友都不是很明白，包括biotek活细胞工作站也是一样，不过没有关系，接下来就来为大家分享关于活细胞工作站和biotek活细胞工作站的一些知识点，大家可以关注收藏，免得下次来找不到哦，下面我们开始吧！
本文主要内容一览
活细胞工作站（biotek活细胞工作站）
1染活死后能染鬼笔环肽吗
鬼笔环肽染料的染色方法：鬼笔环肽 (phalloidin) 是一种双环七肽毒素，它能选择性的与动植物体内的纤维状的肌动蛋白 (F-actin) 结合，这种特殊的选择性使之成为研究细胞内肌动蛋白微丝 (F-actin) 的有力工具。在光学显微镜下, 荧光标记过的鬼笔环肽 (phalloidin-dye conjugate) 可以清晰地显示出细胞内微丝的形态和分布，广泛被应用于生物医学的研究当中。常用来标记鬼笔环肽的荧光染料包括以下几种：FITC, Rhodamine, TRITC or similar dyes, such as Alexa Fluor 488 or iFluor 488.由于鬼笔环肽无法穿越细胞膜， 所以不能直接应用于活细胞的染色；鬼笔环肽实验所用的样品在染色前需要固定， 例如可以用甲醛固定和透化细胞或组织切片，此外标记过的鬼笔环肽也可染色去石蜡后的石蜡包埋的样品。有什么注意事项：鬼笔环肽对pH敏感：提高pH会使结构中关键的硫醚桥键被切断，导致鬼笔环肽失去和肌动蛋白的亲和力。
根据 GLP（Good Laboratory Practice）操作要求，鬼笔环肽具有2mg / kg的 LD50 毒性。但是，实验使用的浓度很低，不会造成重大的危险。
鬼笔环肽染色可与抗体一起使用，可以添加在一抗或二抗孵育步骤时共染。
鬼笔环肽缀合物染色的最佳浓度和孵育时间根据细胞类型，固定条件，样品制备过程 或细胞与组织的通透性不同而有所变化。
避免使用含有甲醇或丙酮的固定剂，这些会破坏肌动蛋白的结构而影响鬼笔环肽染色效果。
悬浮细胞可以使用 poly-D-Lysine 的板或盖玻片贴壁，然后使用贴壁细胞方案染色。
用 PBS+ 1％BSA 的溶液提前孵育一下固定细胞20-30分钟，可能会改善染色。
在使用盖玻片上的细胞染色时，尽量将盖玻片置于有盖子的容器中以减少蒸发。
如果细胞看起来不是非常健康，可以在染色和洗涤时加入 2–10% serum。
当用于未固定的样品时，鬼笔环肽与肌动蛋白 (actin) 的结合会导致微丝末端的解离速率降低，通过防止长丝解聚来稳定肌动蛋白丝 (actin)。
活细胞工作站（biotek活细胞工作站）
2借助光学显微镜可以详细观察活细胞有丝分裂全过程
是可以的,现在的技术看活细胞的分裂是可以实现的,现在又活细胞工作站,只要对染色体进行荧光标记,没有问题的,我看到过全过程的染色体分裂的实验数据.
3判断细胞死活的方法
鉴定细胞死活的方法
死活细胞的鉴定在生物学和医学上具有很重要的意义.细胞培养过程中要随时记录细胞的生长情况,需要经常测定细胞的存活率；在肿瘤细胞的研究中,为了检验各种药物对肿瘤细胞的杀伤力,也需要测定肿瘤细胞的存活率.在临床医学中死活细胞的鉴定也有很大的应用,例如为了检测某一男子的生育能力,测定精子细胞的存活力是比较常用的办法.
死活细胞的鉴定方法有很多种,常用的有染色法和仪器分析法.染色法是常用的细胞死活鉴定方法,简便,易于操作.但是通过直接的形态观察来鉴别细胞死活,实验结果很容易受操作者的主观因素的影响,存在一定的误差,所以,在实际操作中也常采用一些仪器来进行精确的批量检测.
不同的死活细胞鉴定方法有各自不同具体的反应机理,但无论采用何种办法,都是利用了死活细胞在生理机能和性质上的差异.
常用的方法包括染色法和仪器分析法.
1 染色法
染色法分化学染色法和荧光染色法,根据染色机理的不同,染料或使死细胞着色,或使活细胞着色.死活细胞在生理机能和性质上的差异主要包括：
死活细胞细胞膜通透性的差异：活细胞的细胞膜是一种选择性膜,对细胞起保护和屏障作用,只允许物质选择性的通过；而细胞死亡之后,细胞膜受损,通透性增加.常用的以台盼蓝鉴别细胞死活的方法就是利用了这一性质.台盼蓝,又称锥蓝,是一种阴离子型染料,不能透过完整的细胞膜.所以经台盼蓝染色后只能使死细胞着色,而活细胞不被着色.甲基蓝有类似的染色机理.植物细胞的质壁分离也可鉴定死活.
死活细胞在代谢上的差异：是采用美蓝染料鉴定酵母细胞死活的依据.美蓝是一种无毒染料,氧化型为蓝色,还原型为无色.由于活细胞中新陈代谢的作用,使细胞内具有较强的还原能力,能使美蓝从蓝色的氧化性变为无色的还原型,因此美蓝染色后活的酵母细胞无色；而死细胞或代谢缓慢的老细胞,则因它们的无还原能力或还原能力极弱,使美蓝处于氧化态,从而被染成蓝色或淡蓝色.
荧光素双醋酸酯（FDA）是一种常用的培养动植物细胞以及植物细胞原生质体的生活力鉴定染料,其染色机理也利用了死活细胞在代谢上的差异：FDA本身不产生荧光,也无极性,能自由渗透出入完整的细胞膜.当FDA进入活细胞后,被细胞内的脂酶分解,生成有极性的、能产生荧光的物质——荧光素,该物质不能自由透过活的细胞膜,积累在细胞膜内,因而使有活力的细胞产生绿色荧光；而无活力的细胞因不能使FDA分解,而无法产生荧光.
除此之外,还有一些细胞器的专有染料.如液泡系的专有染料中性红.中性红是一种低毒性染料,可以使活细胞液泡着红色,而细胞质和细胞核不被着色；死细胞的液泡不被着色或浅染,染料弥散于整个细胞中,细胞核和细胞质被染成红色.有时侯为了增加染色效果可以将两种染料结合使用,如甲基蓝-中性红混合染色法.
2 仪器分析法
可采用微电极技术（利用死活细胞膜两侧电位的差异）、全自动分析细胞记数仪和流式细胞仪等,可对细胞的死活进行精确的批量检测.
德国INNOVATIS出产的全自动Cedex细胞存活率/细胞计数仪/细胞分析仪是世界上第一台高分辨率、高清晰度扫描(专利)细胞分析仪,具有全自动台盼蓝染色、显微CCD成象、CEDEX工作站软件,可用于制药、医学、发酵、免疫、病理、毒性测试、生物技术等学科的研究开发和工业生产过程中的细胞计数和分析.自动分析结果,检测分析数据输出（11项)：总细胞数目,总细胞浓度 (cells/mL) ；活细胞数目,活细胞浓度 (cells/mL)；死细胞数目,死细胞浓度 (cells/mL) ；细胞存活率 (%) ；细胞的平均圆度 (compactness) ；细胞的平均直径 (um) ；细胞团比例 （Aggregate Rate）；细胞直径分布图 （Diameter Histogram）；细胞团分布图 （Aggregate Histogram）；细胞圆度分布图 (Compactness Histogram) ；细胞生长时间曲线（Cultivation Time Chart）.
流式细胞仪法用来判断细胞死活的常用荧光探针有二大类：一类是能透过活的细胞膜进入细胞内而发出荧光的物质,例如FDA可被活细胞持留而发出黄绿色荧光,若细胞有损伤则会从细胞中流失,观察不到荧光.另一类是不能透过活细胞膜,但能对固定的细胞及膜有破损的细胞的核进行染色,例如碘化丙啶（ PI,Propidium iodide ）和溴化乙锭（ EB,Ethidium bromide ）就是常用的第二类荧光探针.碘化丙啶(PI)不能穿透细胞膜,对于具有完整细胞膜的正常细胞或凋亡细胞不能染色.而对于坏死细胞,其细胞膜的完整性丧失,碘化丙啶(PI)可以染色坏死细胞.目前常用的一种细胞凋亡与坏死检测试剂盒则含有Hoechst 33342和碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)两种荧光染料.细胞发生凋亡时,染色质会固缩,Hoechst 33342可以穿透细胞膜,染色后凋亡细胞荧光会比正常细胞明显增强.上述两种染料双染后,使用流式细胞仪或荧光显微镜检测时,正常细胞为弱红色荧光＋弱蓝色荧光,凋亡细胞为弱红色荧光＋强蓝色荧光,坏死细胞为强红色荧光＋强蓝色荧光.
详见：
4CRISPRCas9基因敲除实验全记录6正式转染单克隆细胞筛选
先确定目标基因CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（1）然后对目的基因进行背景调查CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（2）磨刀不误砍柴工设计sgRNA及引物CRISPR-Cas9（三）--sgRNA设计好之后CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（3）sgRNA及引物设计CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（4）构建sgRNA+Cas9载体转染验证CRISPR/Cas9基因敲除实验全记录（5）293FT细胞转染验证andtroubleshooting
事实上，在转染验证结束后，对于癌细胞等易转染细胞系，基本上可以立刻进行转染，如果载体带有荧光，则根据荧光筛选阳性细胞，若载体为抗生素抗性，而经过抗生素筛选后可直接进行下一步单克隆细胞筛选。对于难以转染的细胞系，可使用电转或者特殊的转染试剂，再根据荧光或者抗性筛选。将细胞消化过筛后种96孔板，每孔种一个细胞，前提是要有活细胞工作站，可以定时拍照1星期以上，从而确定单细胞克隆，如果没有这样的仪器，网络上还有其他筛选单细胞的教程，比如稀释法等等（我觉得直接种1孔1个细胞就OK，种完就找到得力的显微镜全孔拍摄）。总而言之，筛选单细胞这一步依赖于实验室平台的条件。我已经在前两周完成了转染+荧光筛选+扩增冻存一部分，目前种板准备筛选单细胞克隆。由于我养的细胞属于非常难转的细胞系，使用了特殊的转染试剂，转染过后细胞不耐受，荧光筛选之后更加脆弱，实验周期相应拉长。注意，最迟最迟在确认转染成功后开始订购所需的验证性抗体。实验并非一个人可以完成，这和实验室的管理，补给，运营还有实验室成员的帮助有很大的关系，每一个微小的步骤都有可能把人卡得生不如死，希望能顺顺利利，感恩。
2019/09/03
