大家好，如果您还对克隆形成实验不太了解，没有关系，今天就由本站为大家分享克隆形成实验的知识，包括克隆形成实验怎么拍照的问题都会给大家分析到，还望可以解决大家的问题，下面我们就开始吧！
本文主要内容一览
克隆形成实验（克隆形成实验怎么拍照）
1克隆形成实验结晶紫染色后怎么计数
准备一系列在25cm 2 培养瓶中培养的细胞，6组试剂浓度，每组各3瓶，另有3组作对照。每个培养瓶中接种4.5mL细胞悬液（细胞密度为每毫升培养基5×10 4 个细胞），温育48h，胞将进入对数生长期。单层细胞克隆形成实验。细胞以胰蛋白酶消化、计数、稀释后做单层克隆实验：和贴瓶率测试。受试物可于胰蛋白酶消化前或克隆化接种后加入。当集落生长到可用肉眼观察到但并未重叠生长时，将其固定并染色，准备一系列待测物质的稀释液，每组2mL，为所需终浓度的10倍。若是首次测定的化合物，在3～5个对数生长范围内采用5倍稀释。若能预测大致的毒性浓度，可以选择一个较窄的计算范围，每组相隔10或20个数量级。在每组浓度的3个培养瓶中各加入0.5mL10倍浓度的待测化合物，从对照组（不含待测物质，但含有用于毒性测定的溶剂）开始，然后从最低浓度向最高浓度进行。
克隆形成实验（克隆形成实验怎么拍照）
2细胞克隆形成实验可以把细胞全杀死吗
细胞克隆形成实验不可以把细胞全杀死。细胞克隆形成实验是用来检测细胞增殖能力、侵袭性、对杀伤因素敏感性等项目的重要技术方法。当单个细胞在体外增殖6代以上，其后代所组成的细胞群体，成为集落或克隆。其中细胞克隆形成率即细胞接种存活率，表示接种细胞后贴壁的细胞成活并形成克隆的数量。贴壁后的细胞不一定每个都能增殖和形成克隆，而形成克隆的细胞必为贴壁和有增殖活力的细胞。克隆形成率反映细胞群体依赖性和增殖能力两个重要性状。
3克隆形成实验和细胞增殖实验的区别
传代细胞指的是经过传代培养获得的由多个细胞增殖的细胞群. 单细胞克隆指的是我们分离单个细胞,让这个单个细胞增殖,那么产生的后代和都是来源于同一个细胞,就叫单细胞克隆；制作单克隆细胞原理很简单,就是无限倍比稀释（稀释2倍,4倍,8倍、、、、）,直到你再细胞培养板的某个孔里看到了单个的细胞,再让这个单个细胞继续增殖,就成功了.这个实验的关键是一定要保证得到单个细胞才行.
4克隆形成实验24孔板接多少细胞
24孔板一个孔,30——50个细胞已足够。太少，结果不准确；太多，计数太麻烦。当然，这还要根据细胞增殖能力或者说恶性程度来决定。当细胞增殖能力非常强时，可选择少接种一些细胞；当细胞增殖能力很弱时，可增加细胞接种数。
5细胞增殖
增殖是一种在生物医学领域内，非常常见的表型，甚至可以说是最常见的一种表型。
细胞增殖是高等生物体最为重要的生命特征。高等动物体内的细胞，主要有两种增殖的方式。第一种是体细胞的增殖方式：有丝分裂。有丝分裂也是最常见的一种增殖方式。在有丝分裂的过程中，2倍体的体细胞在经过有丝分裂之后，产生两个都是2倍体的后代细胞；另一种是性生殖细胞所采用的增殖方式，被称为减数分裂。减数分裂最大的特点是，2倍体的性生殖细胞，经过减数分裂后，形成2个单倍体的后代细胞。由于细胞在分裂前是2倍体，而分裂后变成了单倍体，使得细胞内的染色体数目变成了原先的一半，因此得名“减数分裂”。
增殖是最为常见的表型。无论是正常生理条件下，还是异常的病理条件下，无论是正常的细胞，还是异常的细胞，增殖现象都是普遍存在的。
一.增殖表型如何检测？
1.分子层面检测增殖表型
有些分子的表达和增殖的表型有密切的关系，因此，只要能检测到这些特定分子的表达，就表征了增殖现象的发生。这类分子就是增殖的marker分子。
常见的和增殖相关的marker分子有如下几种：
（1）与增殖相关的分子标志物
A)MCM（微小染色体维持蛋白，minichromasomemaintenanceprotein，MCM）。MCM只存在于真核细胞中。MCM在有丝分裂的晚期和G1期与染色质紧密结合，在S期和G2期分开。MCM蛋白只在细胞的增殖期才能检测到，它的表达在G1/S转换点达到峰值，在分化期和静息期时，表达缺失，因此可以作为细胞增殖的特殊标志物。
B)细胞核相关抗原Ki-67。这个分子是经典的细胞增殖相关分子标志物，最早在1983年在增殖细胞中发现，目前在病理诊断中使用非常地广泛。Ki-67的一级结构比较特殊，还没有发现与之同源的蛋白，所以目前对于Ki-67的功能了解得不多。推测它可能具有如下的几个功能：1）推测Ki-67可以调节细胞周期；2）Ki-67能和DNA或者RNA发生相互结合；3）Ki-67在细胞分裂期参与合成核糖体。Ki-67在细胞的G0期不表达，G1中期到后期出现表达，S期和G2期表达逐渐增加，有丝分裂期达到高峰，细胞分裂后迅速降解。
C)增殖细胞核抗原PCNA。PCNA又称为周期素，它是DNA聚合酶δ的辅助蛋白。这个分子也是经典的增殖相关分子标志物，最早在1978年就有所报道。又因为PCNA出现在增殖期细胞的细胞核中，所以被称之为增殖细胞核抗原。PCNA的主要功能有：1）DNA聚合酶δ的辅助蛋白；2）参与DNA损伤的修复；3）参与细胞周期的调控；4）和p21相互作用。P21是CDK的抑制因子，因此PCNA通过和p21相互作用，间接影响细胞周期和增殖。在增殖细胞的细胞周期中，PCNA的量会发生明显变化，它在G0/G1期几乎没有表达，G1晚期表达大幅度增加，S期达到高峰,G2/M期表达下降。PCNA也已经广泛应用于临床病理诊断和相关的生物学研究中。
PCNA和Ki-67作为细胞增殖标志物，所存在的一些缺陷。PCNA和Ki-67在G1早期不表达，因此在整个细胞周期过程中，存在表达时间上的间隙。另外PCNA在DNA修复和复制过程中，发挥了作用，这会导致结果的“假阳性”。就是说某些没有发生增殖，但是发生了DNA修复的细胞，也会上调PCNA的表达，这会让研究者误以为细胞发生了增殖。Ki-67也会有类似假阳性现象的存在，比如说Ki-67的表达水平，会受到外部因素的影响，比如在营养缺乏的时候。MCM蛋白相对于PCNA和Ki-67而言，很大的优势在于整个细胞周期中都有表达，而且它不受DNA损伤修复和其他外部因素的影响。因此有的研究者认为，MCM蛋白是优于PCNA和Ki-67的理想的细胞增殖标志物。但是从实际的应用层面看，无论是在临床应用当中，还是在基础科研当中，PCNA和Ki-67的应用，都更加广泛。
（2）和干细胞相关的分子标志物
根据肿瘤干细胞的理论，肿瘤干细胞是肿瘤中，具有自我更新的能力并且能够产生异质性的肿瘤细胞。肿瘤干细胞通过自我更新和无限增殖，维持了肿瘤细胞群的生命力。因此，如果通过肿瘤干细胞相关分子标志物的检测，证实肿瘤干细胞的数量增加，这就提示肿瘤的恶性程度高，间接地说明了肿瘤增殖能力的增强。例如，CD44是胰腺癌中肿瘤干细胞常用的分子标志物，因此可以通过检测CD44的表达水平，证实胰腺癌中肿瘤干细胞的情况，间接地证实肿瘤细胞增殖能力的强弱。但是采用这种方法是具有局限性的，因为不同肿瘤的肿瘤干细胞分子标志物是不同的。而且在很多肿瘤当中，肿瘤干细胞的标志物，还存在很大的争议。所以我个人的建议是，直接检测PCNA或者Ki-67之类的细胞增殖相关标志物更好更直接；检测肿瘤干细胞相关的分子标志物，只能间接地说明肿瘤细胞的恶性增殖情况，只能算是锦上添花而已。
（3）检测抑癌基因
检测抑癌基因相关的分子标志物也是一类和细胞增殖间接相关的分子标志物。检测这一类分子标志物，它存在着如下的一种逻辑推理的过程，首先，在细胞内抑癌基因的表达水平或者活性明显下降，就提示肿瘤的恶性程度明显提升，间接地说明了肿瘤的恶性增殖表型会有所增加。在这一类分子标志物当中常见的抑癌基因有两个：p53和PTEN。经常可以看到在论文当中，通过western或者qPCR，证实p53以及PTEN分子表达水平降低，从而间接地说明肿瘤细胞恶性程度上升，肿瘤的增殖表型也会显著的提升。
2.细胞层面检测增殖表型
（1）直接检测细胞的增殖状态
A）最为经典的方法是MTT法。MTT是一种染料。它的检测原理是活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞没有这个现象。DMSO能溶解细胞中的甲瓒，最后用酶标仪在特定的波长处，测定光吸收值，可间接反映活细胞的数量。MTT法早已成为研究细胞增殖的经典方法。后续基于类似的实验原理，还在MTT方法的基础之上，演化出了各种不同的替代技术，比如CCK8染色实验等等。在做MTT实验的时候，通常取5个时间点（通常就是5天）。把5天中每一天的吸光度数据都记录下来，最后形成一条细胞增殖的曲线。通过比较不同处理方式或者不同实验组之间，细胞增殖曲线的高低，就可以判断细胞增殖情况的快慢。
B）另一种经常用于检测细胞增殖的经典方法是Brdu染色法。Brdu是胸腺密啶的衍生物，可以标记活细胞中新合成的DNA，可以代替胸腺嘧啶，选择性地整合到复制细胞新合成的DNA中。这种渗入可以稳定存在，随着DNA的复制，Brdu可以进入子代细胞中。Brdu特异性抗体可以用于检测Brdu在细胞DNA中的渗入，从而判断细胞增殖能力的变化。通常在使用Brdu单克隆抗体之后，都会结合免疫荧光染色，显示增殖的细胞，同时结合其他细胞标记物，进行双重染色，可以判断增殖细胞的种类，增殖细胞的增殖速度，对研究细胞动力学有重要的意义，因为组织细胞内没有内源性Brdu的存在，所以这种方法用于检测细胞的增殖，应用非常广。另外，通过Brdu染色法可以提供影像学相关的数据，这比单纯采用MTT法（只能提供简单的折线图），要更富有视觉效果。基于Brdu染色方法，又演化迭代出Edu的染色方法。Edu也是一种胸腺嘧啶核苷类似物，能够在DNA复制时期代替胸腺嘧啶，渗入正在合成的DNA分子中。而且在检测的时候，直接采用荧光染料与Edu特异性反应，直接准确地检测出DNA复制活性，能更有效地检测细胞增殖现象。
C)MTT法或者Brdu染色法，这类技术都属于End-pointassay（终点分析法）。因为这类技术对于细胞都有破坏作用，在检测过程中，细胞已经死亡，结构也不再完整。因此，有公司（例如罗氏）研发了实时记录细胞增殖状态的设备和方法，这种设备成为RTCA（realtimecellanalyzer，RTCA）。RTCA这类技术的特点就是实时（realtime）。RTCA实时细胞分析仪，需要用到特定的细胞培养板（被称为E-plate），在E-plate每一个孔的底部都含有特制的电极。电极的作用就是实时记录孔内的电阻抗（electricimpedance）。当细胞在孔内发生粘附，转移，增殖的时候，孔内的电阻抗发生变化，被电极实时记录，研究者也就获得了相关的实时数据。不过需要特别强调的是，采用这种RTCA的方法，不仅仅可以用于细胞增殖的数据的获取，也可以用来检测细胞的黏附，细胞的凋亡、细胞的转移等等，所以它的应用范围是非常广的。
（2）检测细胞的克隆形成能力
肿瘤细胞由于恶性程度高，因而还具有一类特殊的增殖能力--被称为克隆形成能力。正常细胞在增殖的时候，需要细胞与细胞之间的信号传递。这些信号的存在，使得正常细胞增殖过程中，可以有序地受到调控。但是肿瘤细胞具有高度的恶性，它的增殖是不受调控的，所以即便缺少细胞之间的交互和信号通路，肿瘤细胞也可以由单独一个细胞，增殖形成大量的子代细胞，最终形成一个细胞克隆。这种现象就被称之为克隆形成能力，可以通过克隆形成实验，加以检测。
对于干细胞，也有一种类似于克隆形成实验的技术，用于检测干细胞的增殖能力，这种方法被称为“干细胞悬浮成球试验”（microsphereformationassay）。鉴定干细胞需要很多的指标，能在离体条件下，形成微球/悬浮球（microsphere）是鉴定具有干性细胞的方法和指标之一。
3.组织层面检测增殖表型
（1）检测分子标志物
临床上最容易获得的组织样本，通常都是石蜡切片。基于石蜡切片，可以进行免疫组织化学IHC的研究，检测和增殖相关的分子标志物，比如PCNA和Ki-67。
（2）细胞形态和组织结构上的差异
在临床组织样本当中，除了检测和增殖表型相关的分子标志物之外，还可以通过形态学的方式，检测细胞形态的多样性和组织结构上的巨大差异。
通过石蜡切片的染色实验，可以观察到恶性肿瘤细胞一般比正常细胞要大。而且即便是同一种肿瘤，在相同的组织部位，肿瘤细胞的大小和形态也会很不一致，很不均匀，有时甚至会出现巨细胞。在有些肿瘤细胞的细胞核内，会出现细胞核体积增大的现象，这就使肿瘤细胞的细胞核与细胞浆的比例异常。肿瘤细胞的细胞核大小，形状都很不均一，甚至会出现巨核、双核、多核或者是形态奇异的奇异型细胞核。通过详细的形态学观察可以判定细胞发生了恶性增殖。
正常组织当中，是由很多不同类型的细胞所组成。不同类型的细胞在组织内，以特定的、有序的排列顺序，组成了健康的组织。但是在组织内发生肿瘤之后，由于肿瘤细胞发生不受控制的恶性增殖，并且挤压了周围的正常细胞，导致整个正常组织内细胞的有序排列顺序被破坏，组织内不同类型细胞的排列结构发生异常。通过对于组织内部细胞排列顺序和排列结构的检测，也能够获得肿瘤细胞发生恶性增殖的证据。
4.动物层面检测增殖表型
大部分的疾病类型都有与之相对应的，可用于研究的动物模型。在肿瘤研究当中，用于研究增殖相关表型的动物模型，最常见的就是移植瘤动物模型。
在移植瘤当中，为了获取和增殖相关的表型，通常要记录几个参数，比较简单的有肿瘤的大小也就是体积，其次是肿瘤的重量，这些参数是反应肿瘤大小和细胞增殖特性，最直观的数据。有了移植瘤的样本之后，我们还是可以通过降低维度的方式，以移植瘤的样本作为检测对象，检测分子标志物以及检测细胞相关的行为学和形态学。
二.总结
