小鼠甲状腺素（T4）定量检测试剂盒（ELISA）操作方法
实验原理
本试剂盒采用竞争法酶联免疫吸附试验（
小鼠甲状腺素（小鼠注射甲状腺激素）
ELISA）。在预包被抗小鼠甲状腺素（T4）抗体（固相抗体）的微孔酶标板中，加入小鼠甲状腺素（T4）校准品和待测样本，再加入HRP标记的小鼠甲状腺素（T4）抗原（酶标抗原），经过温育与充分洗涤，去除未结合的组分，
在微孔板固相表面形成固相抗体
-酶标抗原的免疫复合物
。加底物
A和B，底物在HRP催化下，产生蓝色产物，在终止液（2M硫酸）作用下，最终转化为黄色，在酶标仪
4
50
nm波长
上测定吸光度（
OD值），吸光度（OD值）与待测样品中小鼠甲状腺素（T4）的浓度负相关。拟合校准品曲线，可以计算出样本中小鼠甲状腺素（T4）的浓度。
试剂盒限制性
1、
仅供科研使用，不得用于临床诊断。
2、
在试剂盒标示的有效期内使用，过期产品不得使用。
3、
跟其他厂家的试剂盒或者组分不能混用。
4、
使用试剂盒配套的
样品稀释
液
。
5、
如果
样本
值高于最高标准
品浓度值
，
请将样本适当稀释后，再重新测定
。
6、
待测样本中存在的人抗鼠等异嗜抗体会干扰检测结果，检测前，请排出该因素。
7、
通过其他方法得到的检测结果，与本试剂盒测定结果不具有直接的可比性。
技术提示
1、
蛋白溶液
时
，避免
起
泡。
2、
加校准品与样本时，每个校准品浓度和样本都要更换移液枪头，公共组分应该悬臂加样，避免交叉污染。
3、
合适的温育时间，和充分的洗涤步骤，是保证实验结果准确性的必要条件。
4、
使用自动洗板机时，
加入一个
的步骤
，可
以
提高检测精度。
5、
底物溶液为无色液体，保存过程中变为蓝色，代表底物溶液已经失效，不得使用。
6、
终止液加样顺序与底物溶液加样顺序一致，加入终止液后，蓝色底物产物，会瞬间变为黄色。
7、
实验中，用剩的板条，应立即放回自封袋中，密封（低温干燥）保存。
8、
所有液体组分，使用前充分摇匀，严格按照说明书标明的时间、加样量及加样顺序进行温育操作。
试剂盒组分与保存
未开封的试剂盒保存在
2-8度，不得使用过期试剂盒。
组分
数量
主要成分
开封后储存
校准品
0.35ml/管
--
2-8
℃
14天
包被微孔板
96T/48T
预包被固相抗体
2-8
℃
14天
HRP标记抗原
10
mL
HRP标记的检测抗原
2-8
℃
180天
底物液
A
6mL
0.01%过氧化氢
2-8
℃
180天
底物液
B
6mL
0.1%TMB
2-8
℃
180天
终止液
6mL
2mol/L稀硫酸
2-8
℃
180天
2
0×浓缩洗涤液
25
mL
0.05%Tween20
2-8
℃
180天
说明书
1份
--
--
自封袋
1个
--
--
不干胶
2片
--
--
标准品浓度依次为：
64
、
32、16、8、4、0
ng/mL
.
其他用品
1、
酶标仪（
4
50
nm）
2、
精密移液器及一次性吸头
3、
蒸馏水
4、
洗瓶或者自动洗板机
5、
37
℃
水浴锅或恒温箱
6、
500ml量筒
生物安全
1、
检测必须符合实验室管理规范的规定，严格防止交叉污染，所有样品、洗弃液和各种废弃物都应按照传染物进行处置。
2、
试剂盒的
液体组分中，含有
procli
n-300防腐剂，
可能引起皮肤过敏反应
，
避免吸入烟雾
与皮肤接触
。
3、
底物液对皮肤、眼睛和上呼吸道有刺激作用，避免吸入烟雾。
4、
戴上防护手套，
实验完成
后洗手。
样品的采集和储存
以下只是列出样品采集和保存的一般指南。所有样本采集保存过程中，不得使用叠氮钠做为防腐剂。
1、
细胞培养上清：
4000rpm条件下离心20min，去除细胞
颗粒
和聚合物，上清液保存
在
℃
以下
，
避免反复冻融。
2、
血清
：
使用不含热原和内毒素的试管，操作过程中避免任何细胞刺激，
4000rpm条件下离心20min，小心地分离出血清，保存
在
℃
以下
，
避免反复冻融。
3、
血浆
：
肝素，
4000rpm条件下，
离心
20
分钟
取上清，血浆保存
在
℃
以下，避免反复冻融。
样本收集后，无法一次检测完毕，请按一次用量分装冻存，避免反复冻融，使用时在室温下解冻，确保样品均匀充分解冻。
4、
组织匀浆：
用预冷的
的重量体积比，比如
1g的组织样品对应9mL的PBS，具体体积可根据实验需要适当调整，并做好记录。推荐在PBS中加入蛋白酶抑制剂)加入玻璃匀浆器中，在冰上充分研磨。为了进一步裂解组织细胞，可以对匀浆液进行超声破碎或反复冻融。最后将匀浆液5000×g离心5-10分钟，取上清检测。
5、
细胞提取液：贴壁细胞用冷的
反
复冻融使细胞破碎
6、
其他生物体液：
试剂准备
1、
使用前，所有的组分都要至少复温
6
0min，确保充分复温到室温。
2、
浓缩洗涤液：从冰箱取出的浓缩洗涤液，会有结晶产生，这属于正常现象，水浴加热使结晶
溶解。
浓缩洗涤液与蒸馏水，按
1:
2
0稀释，即1份的
浓缩洗涤液
，添加
1
9份的蒸馏水
。
3、
底物：
底物液
，在使用前，按
1:1体积充分
混合，
混合后
15分钟内使用。
操作程序
所有试剂和组分都先恢复到室温，标准品、质控品和样品，建议做复孔。
1、
按前面说明书描述的方法，配制好试剂盒各种组分的工作液。
2、
从铝箔袋中取出所需板条，剩余的板条用自封袋密封放回冰箱。
设置标准品孔、空白孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品
50
μ
L，空白孔不加，样本孔加待测样本50
μ
L。
3、除空白孔外，标准品孔和样本孔，加入辣根过氧化物酶（HRP）标记的检测抗原
100μ
L。
4、
用封板膜盖住反应板，
37
℃
水浴锅或恒温箱温育
60min。
5、
揭开封板膜，弃去液体，吸水纸上拍干，每孔加满洗涤液，静置
20
S
，甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复
5次。若使用自动洗板机，请按洗板机操作程序进行洗板，添加浸泡30s的程序，可以提高检测的精度。洗板结束，加底物前，要在干净不掉屑的纸上，充分拍干反应板。
6、
将底物
A和B按1:1体积充分混合，所有孔中加入底物混合液100
μ
L
。
用封板膜盖住反应板，
37
℃
水浴锅或恒温箱温育
15min。
7、
所有孔加入终止液
50
μ
L，在酶标仪上读取各孔吸光度（OD值）。
结果计算
1、
以标准品浓度做为横坐标，对应的吸光度（
OD值）作为纵坐标，利用计算机软件，采用
四参数
，创建标准曲线方程，通过样本的吸光度（
OD值），利用方程计算样品的浓度值。
2、
如果样品被稀释，通过上述方法测的浓度值，要乘以稀释倍数，才是样品的最终浓度。
试剂盒性能指标
1、物理性能
试剂盒的各液体组分应澄清透明、无沉淀或者絮状物。微孔板铝箔袋应真空包装，无破损漏气。
2、剂量反应曲线线性
校准品剂量反应曲线相关系数
r值，大于等于0.9900。
3、精密度
批内精密度：
三
组
已知的
高、中、低
浓度样品
，
进行二十次在
同
一个板块内精度评估。
批内变异系数
CV%小于10%。
批间精密度：
三
组
已知的
高、中、低
浓度样品
，
进行二十次在
不同
板块内精度评估。
批间变异系数
CV%小于15%。
4、灵敏度
小于
0.1ng/mL。
5、回收率
三
组
已知的
高、中、低
浓度样品
，
进行
五
次在
同
一个板块内
回收率
评估
，回收率在
85%-115%之间。
6、特异性
本试剂盒识别天然和重组
小鼠甲状腺素（
T4）
，与结构类似物无交叉。
7、稳定性
2
℃
-8
℃
保存，有效期
6个月。
8、
检测范围
2ng/mL
-
64ng/mL
