大家好，今天给各位分享链霉亲和素磁珠的一些知识，其中也会对链霉亲和素磁珠说明书进行解释，文章篇幅可能偏长，如果能碰巧解决你现在面临的问题，别忘了关注本站，现在就马上开始吧！
本文主要内容一览
链霉亲和素磁珠（链霉亲和素磁珠说明书）
1捕获探针和生物素标记的探针有什么区别
捕获探针和生物素标记的探针本质上是一样的，两种引物是一对的，分别和解链的两条dna结合，起的是同时扩增的作用。探针是用来标记的，只有一条，目的是将基因从基因组中显示出来
链霉亲和素磁珠（链霉亲和素磁珠说明书）
2rnapulldown体外合成探针的序列是相同还是互补
RNA 结合蛋白 ( RBPs ) 是一类功能强大且分布广泛的调节因子，约占细胞中编码的所有蛋白质的 5% 至 10%。
目前，大多数 RNA 通过与蛋白质结合形成 RNA-蛋白质复合物而发挥作用。
随着基因时代的到来，RNA 相关研究已成为生物学的重要组成部分，在肿瘤、糖尿病、肠炎等慢性疾病等领域已被广泛研究，但对 RNA 的作用机制仍知之甚少，各种新发现的 lncRNA、circRNA 与蛋白质相互作用有待进一步研究和发现。
蛋白质与 RNA 的相互作用是许多细胞功能的核心，如蛋白质合成、mRNA 组装、病毒复制、细胞发育调控等，了解它们之间相互作用的分子机制对理解这些生物学过程非常重要。
目前研究 RNA-蛋白质相互作用的方法主要分为两大类：一类是寻找与感兴趣的 RNA 结合的蛋白质，如 RNA pulldown、RAP、ChIRP 等；另一类是找到与感兴趣的蛋白结合的 RNA，如 RIP、CLIP 等。
其中 RNA pulldown 是检测 RNA 结合蛋白与其靶 RNA 相互作用的主要技术之一，是近年来研究 lncRNA、circRNA 与蛋白质相互作用的主要手段。
1.RNA pulldown 原理与应用
1.1 RNA pulldown 的技术原理：
RNA pulldown 技术为研究 RNA 和蛋白质相互作用的核心技术，该技术利用生物素标记的 RNA 和链霉亲和素标记的磁珠高效富集及鉴定 RNA 结合蛋白质（ RBPs ）。
针对目标区域设计生物素标记的特异性 RNA 探针，并与细胞蛋白提取物孵育，形成 RNA-蛋白质复合物。该复合物可与链霉亲和素标记的磁珠结合，经洗脱，得到目的 RNA 探针-蛋白质复合物，最后采用 Western Blot 或质谱鉴定蛋白质类型。
1.2 RNA pulldown 的实验流程：
RNA pulldown 适用于所有的组织或细胞样本，实验操作相对比较简单，其大概实验操作流程如下所示：
1.3 RNA pulldown 的技术应用：
RNA pulldown 可用于研究 lncRNA、circRNA 和 mRNA 等与蛋白质的相互作用，分析与目的 RNA 结合的蛋白种类。
RBPs 调控 mRNA 稳定性、lncRNA 活性等生物学过程，调节转录和翻译、基因表达和 RNA 的加工，介导细胞的发育、分化和代谢等生命过程，在健康与疾病中发挥重要的作用。
在很多疾病（如癌症）的发生机制、预测和治疗中，RBPs 发挥了重要作用。因此，RPBs 逐渐成为研究的热点，而 RNA pulldown 以其优势也被应用到众多的研究中。
3亲和素和生物素解离条件
亲和素（avidin，AV）亦称抗生物素蛋白、卵白素，是从卵白蛋白中提取的一种由4个相同亚基组成的碱性糖蛋白，分子量为68kD，等电点pI=10.5；耐热并耐受多种蛋白水解酶的作用．尤其是与生物素结合后，稳定性更好。生物素与亲和素间的作用是已知强度最高的非共价作用，亲和常数（K）为1015mol/L，比抗原与抗体间的亲和力（K=105～1011mol/L）至少高1万倍。并且，二者的结合稳定性好专一性强，不受试剂浓度，PH环境，抑或蛋白变性剂等有机溶剂影响。由于每个亲和素能结合4个分子的生物素，这一特点可以用于构建一个多层次信号放大系统。因此，BAS即可用于微量抗原、抗体及受体的定量、定性检测及定位观察研究，亦可制成亲和介质用于上述各类反应体系中反应物的分离、纯化。
亲和素由于带有一个糖链侧链，导致容易和细胞表面的多糖发生非特异性亲和。因此，链霉亲和素被开发出来。
链霉亲和素（streptavidin，SA）是由链霉菌streptomyces avidinii分泌的一种蛋白质，分子量为65kD。链霉亲和素分子由4条相同的肽链组成，其中每条肽链都能结合一个生物素，并且不带任何糖基，因此与亲和素一样，一个链霉亲和素分子也能结合4个生物素分子，二者亲和常数（K）亦为1015mol/L。链霉亲和素的适用范围比亲和素更为广泛。
4文库有磁珠有影响吗
文库有磁珠有影响。在文库构建中常用磁珠来进行多余片段去除(链霉亲和素磁珠)、片段分选、文库纯化，也常用来进行DNA纯化，以去除杂质，降低杂质对构建文库的影响。
5DNApulldown实验
原理：
DNA pull down 是一种研究DNA与蛋白互作的方法。其原理是：生物素标记的DNA 片段结合在链霉亲和素磁珠上，再与核蛋白孵育，从而捕获并纯化出与DNA 片段互作的蛋白。捕获的蛋白一方面可以通过Western blot验证某一特定蛋白是否与靶DNA 片段结合；另一方面也可以进行质谱鉴定，筛选出与DNA片段可能互作的蛋白质。
操作步骤：
1.探针制备：
a.对于研究的启动子靶标区域比较明确，且长度较短的DNA片段，可以直接合成并标记上生物素作为pull down探针。
b.对于研究的启动子靶标区域没具体预测区域，一般针对基因上游2000bp序列设计引物，并标记上生物素；然后通过 PCR 扩增的方式钓取基因上游2000bp序列，回收纯化后作为DNA pull down的探针。
2.样本前处理
a. 用 1ml Cell lysis buffer重悬（10^7细胞）;冰上孵育10min，（5000g，4°，5min）离心，弃上清。
b. 加入2/3细胞体积的 Buffer B 悬浮细胞，超声5s裂解细胞。4℃，10,400× g for 5 min离心5min；取上清。
c. 用Buffer D稀释步骤b的上清液，-80℃冻存备用
3.Dynabead MyOne 链霉素亲和素 C1预处理：
a.涡旋震荡磁珠40s，混匀磁珠
b.分装60ul磁珠的1.5mL离心管中；
c.磁力架上放置1min，弃上清；
d.用1mL1X B
e.用60ul 2X B加入60 pmol生物素标记DNA（1ug）;室温颠倒孵育 15 min;
g.磁力架上放置3min,去上清
h.用60 μL 1X B用60ul 1× B/W buffer（without NaCl）洗涤一遍
4.DNA pull down
a.制备binding reaction：加入100 L 5× EMSA buffer 及包含100 g 核蛋白 的上清液；补水至 500 L.
b. 加500ul binding reaction到磁珠中；常温翻转20min
c.磁力架上放置1min，弃上清；
d.用wash buffer 洗涤3遍。
e.回收产物，进行后续WB验证或质谱鉴定。
PS:下边是如期生物DNA pull 项目手册，欢迎各位老师合作交流哈
