农杆菌转化法
经常被拿来当作基因文库载体与微生物生物反应器的大肠杆菌
农杆菌转化法（农杆菌转化法的目的）
大肠杆菌：还是我
转基因的第一步就是获得目的基因，农杆菌转化法，构建对应的基因文库使用相应的探测技术就能获得相应的目的基因。真核生物基因由于具有内含子外显子结构，有时考虑也会使用信使RNA(mRNA)逆转录得到的cDNA文库来获得目的基因，这是考虑到内含子剪切机制的有无和差异。比如在人工胰岛素的大肠杆菌生物反应器中使用的就是cDNA而非原本的人类胰岛素基因，因为大肠杆菌作为原核生物是不具备内含子剪切机制的。通过改变内含子剪切机制同一个基因能够产生多种mRNA，极大的节省了储存空间且方便分化过程，但动物与植物具有不同的内含子剪切机制，不同的物种内含子剪切机制也可能有所不同。大肠杆菌同时还不具备分子伴侣和内质网等结构因此通过大肠杆菌生物反应器得到的胰岛素并不具备完全的立体结构，需要进一步处理才能具有正常活性，农杆菌转化法，这也是很多医用微生物反应器的共同问题
农杆菌转化法的目的
②区别：E·coliDNA连接酶来源于大肠杆菌，只能将双链DNA片段互补的黏性末端之间的磷酸二酯键连接起来；而T4DNA连接酶能缝合两种末端，但连接平末端的之间的效率较低。
（2）与DNA聚合酶作用的异同：
DNA聚合酶只能将单个核苷酸加到已有的核苷酸片段的末端，农杆菌转化法，形成磷酸二酯键。DNA连接酶是连接两个DNA片段的末端，形成磷酸二酯键。
DNA连接酶
DNA聚合酶
不同点
连接的DNA
双链
单链
模板
不要模板
要模板
连接的对象
2个DNA片段
单个脱氧核苷酸加到已存在的单链DNA片段上
相同点
作用实质
形成磷酸二酯键
化学本质
蛋白质
3.“分子运输车”——载体
（1）载体具备的条件：
①能在受体细胞中复制并稳定保存。
②具有一至多个限制酶切点，供外源DNA片段插入。
农杆菌转化法的原理
2.原核基因采取直接分离获得，真核基因是人工合成。人工合成目的基因的常用方法有反转录法_和化学合成法_。
3.PCR技术扩增目的基因
（1）原理：DNA双链复制
（2）过程：
第一步：加热至90～95℃DNA解链；
第二步：冷却到55～60℃，引物结合到互补DNA链；
第三步：加热至70～75℃，热稳定DNA聚合酶从引物起始互补链的合成。
第二步：基因表达载体的构建
1.目的：使目的基因在受体细胞中稳定存在，并且可以遗传至下一代，使目的基因能够表达和发挥作用。
2.组成：目的基因＋启动子＋终止子＋标记基因
（1）启动子：是一段有特殊结构的DNA片段，位于基因的首端，是RNA聚合酶识别和结合的部位，能驱动基因转录出mRNA，农杆菌转化法，最终获得所需的蛋白质。
